Neue Verfahren in der Pflanzenzüchtung

April 2019 | Fachlich-Sachlich

Während bei der klas­si­schen Muta­genese mit Hilfe von Röntgen‑, UV‑, Gamma-​Strahlen oder Che­mi­kalien zufällige Muta­tionen erzeugt werden, ermög­licht es die ziel­ge­richtete Muta­genese, Muta­tionen an defi­nierten Stellen im Genom zu erzeugen. Durch einfach anzu­wen­dende Ver­fahren wie der Gen­schere CRISPR-​Cas und die rasche Umsetzung von Züch­tungs­er­folgen gewinnt die ziel­ge­richtete Muta­genese zunehmend an Bedeutung. 

Bisher wurden die meisten Genfunktions-​Analysen mittels RNAi und Trans­genese erzielt, die zwar wirksam, aber nicht ziel­ge­richtet waren. Seit kurzem werden ver­schiedene Methoden von Genome-​Editing zur gezielten Ver­än­de­rungen im Genom von Mikro­or­ga­nismen, Pflanzen, Tieren und auch beim Men­schen ein­ge­setzt. Das Genome-​Editing kann mit unter­schied­lichen Tech­niken durch­ge­führt werden, wobei immer an vor­her­be­stimmten Stellen gezielt DNS-​Strangbrüche ent­stehen. Diese Maß­nahmen können zu Inser­tionen, Dele­tionen (Indels) oder zum Aus­tausch von DNS-​Sequenzen an spe­zi­fi­schen Orten führen. So kann Genome-​Editing zum gezielten Aus­schalten (Knock-​out) oder Ein­führen eines Gens an einer spe­zi­fi­schen Stelle (Knock-​in), oder zur Kor­rektur einer Punkt­mu­tation ver­wendet werden. 

Technologien im Überblick

ZFN Genome-​Editing. Die künstlich erzeugten Zink­fin­ger­nu­kleasen (ZFN) bestehen aus einer Zink­fin­ger­domäne, die spe­zi­fisch an DNS bindet, und einem Restrik­ti­ons­enzym, welches die DNS schneidet. Danach akti­viert die Zelle ihren Repa­ra­tur­me­cha­nismus, der zu kleinen Ver­än­de­rungen (Indels) in der Gen­se­quenz führen kann. Daher sind ZFN besonders wirksam, um Gen­funk­tionen aus­zu­schalten. Die Enzyme fanden aber keine breite Anwendung, weil sie schwierig her­zu­stellen und sehr teuer sind. 

TALEN Genome-​Editing. Die „Tran­scription activator-​like effector Nucleasen“ (TALEN) bestehen eben­falls aus einer DNS-​bindenden Domäne und einem Restrik­ti­ons­enzym (FokI). Mittels TALEN können an einer bestimmten Stelle im Erbgut gezielte punk­tuelle Mutation her­bei­ge­führt werden, ohne dass in der Pflanze fremdes Gen­ma­terial ent­halten ist. 

Mega­nu­kleasen. Mega­nu­kleasen vom Typ Homing-​Endonukleasen erkennen im Gegensatz zu Restrik­ti­ons­en­zymen wie FokI längere Sequenzen von 20 bis 30 Basen­paaren. Dadurch wird eine Nukle­in­säure auch bei ein­zelnen auf­tre­tenden Punkt­mu­ta­tionen in der Erken­nungs­se­quenz noch geschnitten. 

CRISPR. „Clus­tered Regu­larly Inter­spaced Short Palin­dromic Repeat“ (CRISPR) wurde ursprünglich als pro­ka­ryo­ti­sches Abwehr­system ent­deckt. 2012 zeigten Jen­nifer Doudna und Emma­nuelle Charpentier’s For­schungs­ar­beiten, dass man mit dem CRISPR-​Cas-​System relativ einfach punkt­genaue Ver­än­de­rungen der Erb­sub­stanz vor­nehmen kann. 

CRISPR funk­tio­niert ganz anders als die bisher bekannten Systeme. Mit einer „Sonde“ (CRISPR) kann man DNS-​Bausteine punkt­genau ansteuern und mit einer mole­ku­laren „Schere“ (Cas9) den DNS-​Doppelstrang dort durch­trennen. Grundlage dafür ist das Restrik­ti­ons­enzym namens Cas9, das mit Hilfe einer kurzen „guide RNA“ an seine Ziel-​DNS geleitet wird. Während der fol­genden Repa­ratur durch den zellei­genen Repa­ra­tur­me­cha­nismus treten Lese­fehler auf, wodurch Gene aus­ge­schaltet (Knock-​out), gewünschte Sequenzen ein­gefügt (Knock-​in) oder Modi­fi­ka­tionen erzielt werden können. 

Unterschiede zu bisherigen Methoden

Die Ein­stufung von Talen, ZFN und CRISPR-​Cas zur züch­te­ri­schen Ver­bes­serung von Nutz­pflanzen ist für die Anwend­barkeit dieser Methoden in der Pflan­zen­züchtung von emi­nenter Bedeutung. Aus wis­sen­schaft­licher Sicht sind mittels Gen-​Editing erzeugte Pflanzen nicht auto­ma­tisch als GVOs (Gene­tisch Ver­än­derte Orga­nismen) zu betrachten, vor allem wenn bei der Behandlung keine zusätz­lichen DNS-​Bausteine ein­gebaut werden. Dies wäre nämlich typisch für GVOs, wie sie in den RL 90/​220/​EEC und 82/​472/​EEC defi­niert wurden. Gelingt es aber z.B. mittels CRISPR-​Cas die Mutation als eine Deletion oder einen Aus­tausch von Basen zu erzielen, so tragen diese Pflanzen keine zusätz­lichen neuen DNS-Bausteine. 

Uni­ver­si­täts­pro­fessor Stefan Jansson von der Uni­ver­sität Umea hat der König­lichen Schwe­di­schen Aka­demie der Wis­sen­schaften (KVA) und den schwe­di­schen Behörden anhand von fünf Ara­bi­d­opsis PsbS Mutanten (siehe Kasten 1: „A GMO or not a GMO?“) die Frage gestellt, welche davon einer Ein­stufung als GVO unter­liegen würden. Mutanten A und B sind von der Euro­päi­schen GVO-​Richtlinie nicht betroffen. Mutante C ist, obwohl die T‑DNS-​Sequenzen in Pflanzen wie Tabak und Süß­kar­toffel natürlich vor­kommen, als GVO ein­ge­stuft. Mutante D enthält noch Fremd-​DNS und wird daher als GVO betrachtet. Mutante E enthält keine Fremd-​DNS und ihr fehlen nur einige Basen­paare im PsbS Gen. 

Bedeutet dieses Ent­fernen einiger Basen­paare eine Neu­kom­bi­nation von gene­ti­schem Material? Wahr­scheinlich nicht. Im Ver­gleich zu Mutanten A und B wäre es unlo­gisch, Genom-​editierte Pflanzen den Anfor­de­rungen der GVO Richt­linie zu unter­werfen. Die schwe­di­schen Behörden waren der Emp­fehlung der KVA gefolgt und hatten die CRISPR-​Pflanzen (D&E), ebenso wie die Bestrah­lungs­mu­tante (A) und die che­misch indu­zierte Mutante (B) im Gegensatz zur trans­genen Mutante © als nicht unter die GVO Gesetz­gebung fallend beur­teilt. Warum sollten mittels CRISPR-​Cas erzeugte Pflanzen, die eine ver­gleichbare Mutation tragen wie sie durch Bestrahlung oder che­mische Muta­genese erzeugt wurde, anders regu­liert werden? 

Das besondere Potenzial der neuen Methoden

Mit Hilfe dieser neuen ziel­ge­rich­teten Methoden können Punkt­mu­ta­tionen ziel­genau ein­gefügt werden und die Züchtung ist weniger vom Zufall abhängig. Die Züchtung ist heute auf relativ wenige Arten fokus­siert, damit könnten nun auch weniger domes­ti­zierte Pflanzen effi­zient bear­beitet werden. Die mensch­liche Ernährung könnte aus­ge­wo­gener und variabler gemacht werden; Pflanzen könnten für öko­lo­gische Nischen und besondere Umwelt­be­din­gungen adap­tiert werden und so besser mit ver­än­der­lichen Kli­ma­be­din­gungen zurechtkommen. 

Das wohl augen­schein­lichste Bei­spiel für einen mög­lichen unmit­tel­baren Vorteil sind mittels CRISPR-​Cas edi­tierte Nutz­pflanzen mit redu­ziertem All­er­gen­gehalt, z.B. Äpfel, Erd­nüsse, Pfir­siche, aber auch Reis, Weizen und Mais. Bei Bio­die­sel­pflanzen könnten mittels CRISPR-​Cas die Ölzu­sam­men­setzung ver­ändert und der Toxin- und All­er­gen­gehalt ver­ringert werden, um einer­seits ver­füt­terbare Press­kuchen zu gewinnen und ande­rer­seits die Expo­sition bei der Bear­beitung zu verringern. 

Der wich­tigste Vorteil: CRISPR-​Cas ist einfach und günstig anzu­wenden und daher auch für kleine Firmen zugänglich. Inzwi­schen wurden erstaunlich viele Wei­ter­ent­wick­lungen und Ver­bes­se­rungen, die mög­liche Schwach­punkte wie etwa das Off-​Target-​Spalten ver­hindern, entwickelt. 

Aktuelle Anwendungsbereiche

Genome-​Editing wird bei Kul­tur­pflanzen, aber auch bei Zier­pflanzen ein­ge­setzt. Dabei geht es zum Bei­spiel um die Ver­bes­serung der Lebens– bzw. Fut­ter­mit­tel­qua­lität, die Ver­bes­serung der Toleranz gegen abio­tische und bio­tische Stress­fak­toren, die Modi­fi­kation agro­no­misch rele­vanter Merkmale, die indus­trielle Nutzung und die Erzeugung her­bi­zid­to­le­ranter Pflanzen. 

Über die Datenbank des United States Department of Agri­culture (USDA) „Am I Regu­lated?“ kann man bei der US Behörde anfragen, ob neue Pflan­zen­züch­tungen als GVOs ein­ge­stuft werden oder nicht. Genom-​editierte Pflanzen ohne „art­fremdes“ Gen­ma­terial werden in der Regel nicht als GVO ein­ge­stuft und können ohne Geneh­migung frei­ge­setzt und ver­marktet werden. Bis August 2018 wurden 25 Anfragen zu Genom-​editierten Pflanzen (13 Kul­tur­arten) als Nicht-GVO ein­ge­stuft, etwa Mehltau-​resistente Tomaten und Weizen (CRISPR), Weizen mit nied­rigem Glu­ten­gehalt (CRISPR), besser lager­fähige Kar­toffeln, Raps mit ver­bes­serter Fett­säu­re­zu­sam­men­setzung und Scho­ten­fes­tigkeit (CRISPR), von Tieren besser ver­daubare Luzerne, Mais mit spe­zi­eller Stär­ke­zu­sam­men­setzung, Leind­otter mit höheren Ölgehalt und Cham­pi­gnons, die nicht ver­färben (CRISPR) sowie Soja mit ver­än­dertem Ölgehalt (TALEN).

Derzeit werden mehr als 50 Kul­tur­pflan­zen­arten mit den neuen Genome-​Editing-​Verfahren beforscht, ange­führt von Reis, gefolgt von Mais, Weizen, Soja­bohnen, Kar­toffel und Tomaten, aber auch Gemü­se­arten, Obst, Wein und Zier­pflanzen. Bei 80 Prozent der etwa 1200 Publi­ka­tionen handelt es sich um Grundlagenforschung. 

In einer Studie des Julius Kühn-​Instituts, des deut­schen Bun­des­for­schungs­in­stituts für Kul­tur­pflanzen vom Sep­tember 2018 sind 102 Züch­tungs­pro­jekte ange­führt, die als „markt­ori­en­tiert“ oder „marktreif“ ein­ge­stuft sind. Die meisten stammen feder­führend aus China (541), gefolgt von den USA (387), Japan (87) und Deutschland(81).

In den USA sind 2018 erstmals Genom-​editierte Soja­bohnen geerntet worden, die in den letzten fünf Jahren von Calyxt mittels TALEN ent­wi­ckelt wurden. Diese Soja­bohnen ent­halten weniger gesät­tigte Fett­säuren, dafür deutlich mehr der gesund­heitlich wert­vol­leren Ölsäure. Der große Vorteil daraus gewon­nener Spei­seöle und ‑fette: Bei hohen Tem­pe­ra­turen bilden sich weniger Trans-​Fettsäuren. Im nächsten Jahr kommen davon Spei­seöle oder Müs­li­riegel in den Handel – vor allem im Segment hoch­wer­tiger Pro­dukte für gesund­heits­be­wusste Ver­braucher. Auch bei Weizen, Kar­toffeln, Raps und Alfalfa (Luzerne) hat Calyxt das TALEN-​Verfahren ange­wandt. Kon­zerne wie DuPont, Pioneer und Syn­genta, aber auch mehrere kleine Tech­no­lo­gie­un­ter­nehmen (Arcadia) oder Startups (Yield10, Bio­science) arbeiten an Markteinführungen. 

Entscheidung des Europäischen Gerichtshofs

Experten aus ver­schie­denen Ländern haben vor­ge­schlagen, dass Gen-​editierte Pflanzen, sofern sie keine Fremd-​DNS ent­halten, Pflanzen aus kon­ven­tio­neller Züchtung gleich­zu­stellen sind. Zurzeit ist es in der EU aller­dings noch unklar, ob Gen-​editierte Orga­nismen als GVOs ein­zu­stufen und somit die für GVO gelten Richt­linien anzu­wenden sind. 

Für Auf­sehen sorgte daher die Ent­scheidung des Euro­päi­schen Gerichtshofs vom 25. 7. 2018, dessen Beant­wortung einer fran­zö­si­schen Anfrage weder der Meinung des Gene­ral­staats­an­walts vom Jänner 2018 noch der Schwe­di­schen Behörden und der KVA ent­sprach. Der Euro­päische Gerichtshof urteilte, dass Muta­tionen im Pflan­zen­genom, die mit neuen Züch­tungs­tech­niken wie CRISPR-​Cas erzeugt werden, als Gen­technik ein­zu­stufen sind. Dazu werden aber vor­aus­sichtlich noch weitere Klä­rungen der gesetz­lichen Aus­legung dieses Bescheides erfor­derlich sein. Der Ent­scheid des EUGH ist auch hin­sichtlich der Defi­nition der Aus­nahme der bestrahlten Mutanten schwer nach­voll­ziehbar, denn er betrachtet diese zwar als GVOs, nimmt sie aber von der Regu­lierung aus. Ansonsten würden viele im Bio­landbau ver­wendete Sorten stark unter Druck geraten. 

Die aktuelle Dis­kussion bringt daher eher zum Aus­druck, dass sich die EU ehr­li­cher­weise zu einer pro­dukt­ori­en­tierten Bewertung der Gen-​editierten Pflanzen im Gegensatz zum bisher prak­ti­zierten metho­den­ori­en­tierten Bewer­tungs­ansatz hin­be­wegen bzw. wei­ter­ent­wi­ckeln sollte. Tat­sächlich bietet eine pro­dukt­ori­en­tierte Bewertung, wie sie z.B. in den USA, aber noch viel mehr in Kanada für alle Neu­züch­tungen gilt, für die Kon­su­men­tinnen eine äqui­va­lente Sicherheit, denn die End­pro­dukte müssen sorg­fältig geprüft werden, bevor sie auf den Markt gelangen. 

Mögliche Konsequenzen

Neben den USA und Kanada wollen viele große Agrar­pro­du­zenten außerhalb der EU, etwa Argen­tinien, Bra­silien, Kolumbien, Chile, Israel und Aus­tralien in jedem Ein­zelfall über neue Genom-​editierte Pflanzen ent­scheiden. Wenn keine fremde DNS neu ein­ge­führt wurde, dann fallen sie in der Regel nicht unter die Bestim­mungen für GVOs und dürfen ohne weitere Auf­lagen angebaut werden. In etlichen wei­teren Ländern laufen Dis­kus­sionen zur recht­lichen Einordnung. 

Dies wird unwei­gerlich Kon­se­quenzen für Han­dels­be­zie­hungen mit sich bringen. Je mehr Genom-​editierte Pflanzen in Ländern außerhalb der EU auf die Felder kommen, umso größer werden die Her­aus­for­de­rungen. In Zukunft wird es kaum zu ver­hindern sein, dass Genom-​editierte Pflanzen in Importen von aus­län­di­schen Agrar­pro­dukten uner­kannt nach Europa gelangen. 

 

„A GMO or not a GMO?“ 

Welche der­selben Ara­bi­d­opsis tha­liana PsbS Mutanten, die mit Hilfe von ver­schie­denen Methoden (A–E) her­ge­stellt wurden, fallen unter die GVO-​Gesetze der EU? Das Protein Pho­to­system II Subunit S (PsbS) spielt in der Pho­to­syn­these eine Rolle als Sicher­heits­ventil”. Pflanzen ohne dieses Protein zeigen eine redu­zierte Fitness und geringere Samen­pro­duktion. Mutanten, denen das Gen fehlt oder die ein dys­funk­tio­nales Protein pro­du­zieren, wurden mit ver­schie­denen Methoden erzeugt. 

A. Bestrah­lungs­mu­tante

Die erste PsbS-​Mutante wurde durch Bestrahlung mit schnellen Neu­tronen erzeugt. Die dadurch erzeugten Schäden (Brüche) in der DNS werden von der zellei­genen Repa­ra­tur­ma­schi­nerie aus­ge­bessert. Während dieses Repa­ra­tur­vor­gangs wurde bei­spiels­weise das ganze PsbS-​Gen ent­fernt und fehlte daher in der gesamten Pflanze. Auch in anderen Genen könnten Ver­än­de­rungen auf­ge­treten sein. 

B. Che­misch indu­zierte Mutante

Die zweite PsbS-​Mutante wurde durch Behandlung mit Ethyl­me­than­sul­fonat (EMS) erzeugt. Ein Buch­stabe im PsbS Gen wurde aus­ge­tauscht, was zu einem dys­funk­tio­nalen Protein führte.

C. Transgene Mutante mittels T‑DNS

Die dritte PsbS-​Mutante wurde durch T‑DNS-​Transfer mit­hilfe des Boden­bak­te­riums Agrob­ac­terium tum­e­faciens erzeugt. Die T‑DNS wurde in das pflanz­liche PsbS-​Gen ein­gebaut, was zu einer Unter­bre­chung und damit Funk­ti­ons­verlust des Gens führte. 

D. & E. Genom-​editierte Mutanten

Die neueste Methode zur Erzeugung von PsbS Mutanten ist das Geno­me­di­tieren durch die CRISPR-​Cas-​Methode. Dieses System erzeugte zwei Dop­pel­strang­brüche an vor­her­be­stimmten Stellen im PsbS-​Gen. Die DNS-​Reparaturmaschinerie repa­rierte den Bruch und ent­fernte ein Stück DNS, was zu einem dys­funk­tio­nalen PsbS Protein führte. Die inter­me­diäre Mutante (D) ent­hielt noch Fremd-​DNS zur Pro­duktion des CRISPR-​Cas-​Komplexes, der zum Dop­pel­strang­bruch führte. Die finale Mutante (E) ent­stand aus Mutante D durch Selbst­be­stäubung, ent­hielt keine Fremd-​DNS und unter­schied sich von der Aus­gangs­pflanze nur durch eine kleine Deletion im PsbS Gen.

 

 

Univ.-Prof. Dr. Margit Laimer, Uni­ver­sität für Boden­kultur Wien, Department Bio­tech­no­logie, Abteilung für Pflan­zen­bio­tech­no­logie, Muth­gasse 18, 1190 Wien, margit.laimer@boku.ac.at

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